211service.com
Snabbläsande DNA tum närmare
För att DNA-sekvensering ska bli en rutinmässig del av patientvården måste den bli billigare och snabbare. Ett företag ringde Oxford Nanopore hoppas kunna få ner både kostnaden och tiden som krävs för sekvensering med en teknik som kallas nanopore-sekvensering. Företaget har nu gjort en viktig demonstration av sin teknologi: för första gången kunde forskare identifiera DNA-baser med nästan total noggrannhet. Förutom att identifiera de fyra baserna av DNA, kan tekniken också upptäcka en modifierad version av en av baserna, som kan vara ansvarig för att orsaka cancer och andra sjukdomar.
Hastighetsläsare : En DNA-bas (röd) passerar genom en proteintunnel fodrad med ett socker (blå och gröna bubblor). Sockret saktar ner DNA när det rör sig genom poren, vilket ger tid för basen att identifieras.
Den nya tekniken möjliggör direkt identifiering av baser utan de fluorescerande etiketter och bildutrustning som används för konventionell höghastighetssekvensering. Direktavläsning av DNA ska inte bara vara snabbare och billigare, utan det ska också göra det möjligt att utföra mer komplex analys, säger Jeffrey Schloss, programdirektör för teknikutveckling vid U.S. National Human Genome Research Institute . Oxford Nanopore-systemets förmåga att upptäcka DNA-modifieringar som katalogiserats av ett framväxande område som kallas epigenetik är särskilt spännande, säger Schloss. Till exempel har tillsatsen av organiska molekyler som kallas metylgrupper till en av baserna visat sig spela en roll i utvecklingen av sjukdomar som cancer. Men det är svårt att upptäcka dessa modifieringar med konventionella sekvenseringsmetoder, så de fullständiga effekterna och varför de inträffar är fortfarande inte väl förstått.
Oxford Nanopore-forskare har ännu inte visat att de kan bearbeta kompletta DNA-sekvenser med sitt system. Men de nya resultaten, publicerade denna vecka i Naturens nanoteknik , är ett viktigt proof of concept för nanopore-sekvensering. De har visat genomförbarheten av alla steg, säger Schloss.
Systemet som företaget använde för att identifiera DNA-baser är ett tunnelliknande protein inbäddat i ett membran mycket likt det som omger biologiska celler. Flödet av joner över membranet och genom porerna skapar en ström som kan mätas med en elektrod som liknar de som används för att studera neuroner i labbet. Genom att applicera en stark elektrisk potential över membranet driver forskare DNA-baser genom poren. När varje bas passerar genom, modifierar den strömmen som flyter över poren på ett karakteristiskt sätt.
Nyckeln till att få metoden att fungera är att kontrollera flödet av baserna genom proteinporen. DNA-baser är för små för att kunna identifieras på egen hand: de skulle flyga igenom, säger James Clarke, en forskare vid Oxford Nanopore. Så en sockermolekyl som kantar öppningen bulkar upp den så att DNA:t inte glider igenom för snabbt. I tidigare versioner av nanopore-systemet var denna sockermolekyl ganska löst associerad med poren och rörde sig in och ut. Företagsforskare ledda av grundare Hagan Bayley , som också är professor i kemi vid University of Oxford, gjorde det möjligt att läsa DNA-baser efter varandra genom att kemiskt binda sockret till insidan av nanoporen.
Oxford Nanopore kan identifiera baser, men ännu inte i sekvens. Systemet som det har visat innebär att man passerar hackat DNA, inte hela strängar, genom nanoporen. Företaget arbetar nu med en uppsättning för att mata långa DNA-strängar genom poren en bas i taget. För att göra detta måste forskarna fästa ett enzym som kallas exonukleas till nanoporen. De hoppas att baser kommer att hackas av en i taget av enzymet och kommer att passera genom poren till andra sidan.
Det finns en fråga [om] vad som kommer att hända när du lägger långa DNA-strängar framför nanoporen, säger Schloss. Kommer det att bilda en hopplös knut?
Detta är bara en av flera okända saker som forskare konfronteras med. För att göra tekniken verkligt skalbar och kommersiellt gångbar kommer porerna att behöva grupperas i stora arrayer, och företaget kommer att behöva utveckla ett mindre komplicerat sätt att läsa av de elektriska signalerna från porerna. Oxford Nanopore säger att man för närvarande arbetar med båda dessa problem.
En potentiell fallgrop med Oxfords tillvägagångssätt för nanopore-exonukleas, säger Schloss, är att DNA:t kommer att förstöras när det har lästs, vilket gör det omöjligt att återsekvensera en sträng för att kontrollera fel.
Det finns dock andra tillvägagångssätt för nanoporesekvensering som är mindre destruktiva. David Deamer , emeritus professor i kemi vid University of California, Santa Cruz, som först kom på konceptet med nanoporesekvensering på 1990-talet och är vetenskaplig rådgivare för Oxford Nanopore, påpekar att detta inte är den första demonstrationen av ett nanoporesystem som kan identifiera alla DNA-baser. Förra året ledde forskare av Reza Ghadiri vid Scripps Institute, i La Jolla, CA, sekvenserade en 10-baser lång DNA-sträng med en annan nanopore-teknik. Flödet av DNA genom Scripps-systemet, som är baserat på Deamers ursprungliga koncept, kontrolleras av ett enzym som fungerar som en spärrhake och för molekylen framåt en bas i taget. Men det här systemet är alldeles för långsamt och avancerar med en hastighet av en bas var tionde minut, och Scripps-forskarna arbetar på att påskynda det.
Oxford Nanopore har inte lagt alla sina ägg i en korg. Den har licensierat teknik för flera nanopore-sekvenseringsmetoder, inklusive Deamer's och en annan som använder en konstgjord nanopore: en kiselwafer stansad med nanoskala hål och fodrad med kolnanorör vars konduktans ändras när DNA:t passerar.
Ett av dessa tillvägagångssätt kommer att få ett genombrott och kommer att kunna sekvensera i en takt snabbare och billigare än vad vi gör nu, förutspår Deamer. Varken forskarna vid Oxford Nanopore eller de på konkurrerande laboratorier är villiga att spekulera om exakt när detta kommer att hända, eller vad ett sådant system skulle kosta per genom. Men Schloss säger att det är möjligt att en av grupperna kommer att uppfylla National Human Genome Research Institutes ursprungliga målår 2014 för framgångsrik nanopore-sekvensering.