Sekvensering i en blixt

Den 6 februari 2007 visade chefer från 454 Life Sciences 78-årige James Watson ett första utkast till sitt eget genom. Det var något rent poetiskt med detta. Watson hade naturligtvis vunnit ett Nobelpris 45 år tidigare för sin roll i upptäckten av DNA:s dubbelspiralformade struktur; han var också en pådrivare bakom Human Genome Project, som genom sitt slutförande 2003 hade spenderat nästan 3 miljarder dollar under 13 år på att utvinna ritningen som dessa helixar kodar för. Nu hade 454 tagit ett steg bortom det megaprojektet, som slog ihop många människors DNA för att bestämma den genetiska sekvensen för vad som motsvarar en modellmänniska. Företaget och dess så kallade nästa generations sekvenseringsmaskin hade på egen hand läst den genetiska koden för en individ – en vars arbete hade gjort så mycket för att göra prestationen möjlig.

454:s Jonathan Rothberg tror att hans maskiner kommer att göra sekvensering så billig och snabb att det kommer att bli praktiskt att läsa av individers genom.

Men Jonathan Rothberg, som grundade 454 i Branford, CT, med drömmen om att producera en sekvenseringsmaskin som är effektivare än de som är tillgängliga för Human Genome Project, nämner inte poesi när han berättar om sitt möte med Watson. Snarare talar han om pengar, snabbhet och en framtid där vanliga människor bär runt sina personliga genom på skivor – ett allt mer rimligt scenario. Det kostade oss 200 000 dollar att göra Jim Watson, påpekar Rothberg. Och vi gjorde det mest i december och januari.

Den här historien var en del av vårt majnummer 2007

• Se resten av frågan
• Prenumerera

Rothberg, som nu är ordförande i 454:s styrelse, betonar att Project Jim fortfarande är ett pågående arbete och kommer att kräva mer tid och pengar. I februari hade företaget sekvenserat Watsons DNA endast tre gånger (varje körning ökade noggrannheten och fyllde luckor); nio pass krävdes för att producera Human Genome Projects slutliga utkast till sekvens. Men ändå.

Rothbergs företag är bara ett av flera, inklusive Illumina från San Diego och Applied Biosystems i Foster City, CA, som utvecklar maskiner som kan avkoda DNA snabbare än någonsin tidigare. Och precis som kostnaden för datorkraft har rasat i takt med den stadigt ökande tätheten av transistorer på chip, har priset för sekvensering av DNA sjunkit snabbt med tillkomsten av dessa maskiner. Idag skulle prislappen på ett mänskligt genom som avkodats med sekvenserare av den typ som används i Human Genome Project vara 25–50 miljoner dollar. Det sjunker till cirka 1 miljon dollar med nästa generations maskiner tillgängliga idag och kan vara så lågt som 100 000 dollar 2008.

Multimedia

• Se en grafik över sekvenseringens hemligheter.

Som datorernas historia har visat kan mer processorkraft för mindre pengar leda till oväntade applikationer. I kölvattnet av Human Genome Project stod forskare inför svåra ekonomiska beslut om vilka genom som skulle sekvenseras härnäst: schimpans eller makak, ko eller delfin, ris eller kassava. De nya maskinerna gör det möjligt att sekvensera nästan allt av intresse. Och när allt mer sekvensdata flödar in i databaser öppnar sig helt nya forskningsområden. Forskare har nu en aldrig tidigare skådad förmåga att göra jämförelser mellan arter och belysa allt från evolutionära frågor till genetiska orsaker till individuella skillnader i sjukdomsresistens och mottaglighet. Forskning gjord med 454:s maskiner och publicerad i topptidskrifter inkluderar partiell sekvensering av ett neandertalgenom och utveckling av nya tester för cancerframkallande genetiska mutationer – teknologi som kan hjälpa läkare att skräddarsy behandlingar för sina patienter.

Det senaste året har varit den mest spännande perioden inom genomik sedan Human Genome Projects dagar, säger Eric Lander, första författare på projektets första publicerade utkast till det mänskliga genomet och nu chef för Broad Institute for genomic medicin i Cambridge, MA . Sekvensering blir tillräckligt billig och kraftfull nog att den kan appliceras på alla problem. Det står fältet på huvudet. Francis Collins, som ledde Human Genome Project för National Institutes of Health, förutspår att de nya sekvenseringsteknologierna kommer att få djupgående konsekvenser för framtiden för biomedicinsk forskning och, i slutändan, för utövandet av medicin.

En unik lösning
Jonathan Rothbergs kontor har ett diner-tema, med ett rött och svart rutigt kakelgolv, röda Naugahyde-klädda kromstolar och en soffa med armar som imiterar baksidan av en Cadillac från 1959, komplett med monsterbakfenor och kulformade baklyktor . Istället för ett skrivbord har han en dinerbar med barstolar. Vinflaskor från en vingård i Connecticut som han äger kantar några av hyllorna. Bortom fönstren ligger Long Island Sound. Platsen skriker jag är unik . Och så är Rothberg. 1991, när han avslutade sin doktorsexamen i biologi vid Yale University, startade han CuraGen, ett av de första företagen att utveckla läkemedel baserade på genomik. Förutom CuraGen och 454 Life Sciences har han grundat ett institut för studier av barnsjukdomar och ytterligare ett bioteknikföretag, RainDance Technologies, som har utvecklat vad det kallar vätskekretskort som är designade för att göra experiment mer effektiva genom att manipulera små mängder av vätska. Och allt det vid 43 års ålder.

Det var faktiskt ett intresse för det unika hos varje person som till slut fick honom att försöka designa en sequencer som han hoppas en dag kommer att göra genomkontroller lika rutinmässiga som blodprover är nu. Rothberg håller upp tarmen på 454-maskinen, en glasskiva med 1,6 miljoner miniatyrbrunnar, var och en cirka 50 mikrometer bred (ungefär hälften av ett människohår) och 55 mikrometer djup. Det är detta chip som gör att maskinen kan sekvensera DNA så snabbt, eftersom en separat kemisk reaktion kan utföras i varje brunn.

Gensekvensering drar fördel av det faktum att de två strängarna i en DNA-spiral är komplementära: av de fyra kemiska baserna adenin, guanin, tymin och cytosin, som är uppträdda i olika ordningsföljder på varje sträng, parar adenin endast med tymin, och guanin endast med cytosin. I den vanligaste sekvenseringstekniken, som bygger på ett schema som utvecklades för 30 år sedan av University of Cambridges Frederick Sanger, separeras fragment av DNA i enkelsträngar och exponeras för fria nukleotider, som binder till de ursprungliga As, Cs, Ts, och Gs för att generera nya komplementära strängar. Dessa strängar varierar i längd eftersom några av de fria nukleotiderna har modifierats för att förhindra att reaktionen fortsätter; när en av dessa baser binder till sitt mål, slutar kedjan att växa. Och var och en av dessa fyra typer av kedjeterminatorer har en annan fluorofor fäst som fluorescerar när den träffas av en laserstråle. En elektrisk ström separerar strängarna efter storlek och lasern läser av färgerna för att avgöra vilken som var den sista basen som lades till i varje kedja och stavade sekvensen. De allra flesta labb som gör sekvensering idag använder en maskin tillverkad av Applied Biosystems som spottar ut cirka två miljoner baser om dagen.

Den senaste sequencern från 454 kan läsa 300 miljoner per dag.

454-metoden undviker flera av de mer tidskrävande stegen av konventionell sekvensering, såsom separation av strängar efter storlek. Till skillnad från Sanger-sekvensering, avslutar den inte kedjor: den registrerar baser när de läggs till en växande sträng. Först hackas en DNA-molekyl slumpmässigt i olika längder. Sedan strippas varje fragment till enstaka strängar och varje sträng fästs till en separat liten pärla. En biokemisk process kopierar de enskilda strängarna, så att 10 miljoner kloner sticker ut från varje pärla. Varje pärla packas sedan i en av de 1,6 miljoner brunnarna. Som, Cs, Ts och Gs sköljer över brunnarna sekventiellt för att syntetisera nya komplementära strängar.

Här är den verkligt smarta delen: med en metod som först beskrevs av Pål Nyrén och kollegor på Sveriges Kungliga Tekniska Högskolan, registrerar 454:s sekvenserare omedelbart när en bas läggs till varje sträng genom att utnyttja det faktum att bindningsreaktionen frigör en kemikalie som kallas pyrofosfat. I brunnarna på 454-maskinen fångas pyrofosfatet av en kemisk kaskad som slutar med att snärta på enzymet luciferas (som förekommer naturligt i eldflugor) – och avger en ljusskur. En standard laddningskopplad enhet av det slag som används i digitalkameror och teleskop upptäcker varje blixt och läser av sekvensen av As, Cs, Ts och Gs i varje fragment. Processen kan läsa cirka 200 till 300 baser i rad. Som i konventionell sekvensering letar datorer sedan efter matchande sekvenser i slutet av ett fragment och början av ett annat, och sätter ihop fragmenten i rätt ordning.

Sequencern som 454 kom ut på marknaden i oktober 2005 hade några allvarliga begränsningar. Den kunde bara läsa 100 baser i rad (ju längre sträcka av baser i varje sekvenserat fragment, desto lättare är det att sätta ihop ett komplett genom), och det hade också problem med att noggrant kartlägga repetitiva sträckningar - säg sex As rygg mot rygg. Men Rothberg säger att 454:s filosofi var Get it out early; få det accepterat. Företaget riktade sig först mot tidiga användare som Broad's Lander, i hopp om att de snart skulle publicera resultat som förlitade sig på sequencern. Du måste skaffa tidiga killar först, men resten av killarna, anhängarna, är där marknaden finns, säger Rothberg. Och de läser peer-reviewed tidningar.

Neandertalare
En uppsats av en tidig användare som fick stor uppmärksamhet från både forskare och allmänheten var en studie av neandertal-DNA ledd av Svante Pääbo vid Max Planck-institutet för evolutionär antropologi i Leipzig, Tyskland. Neandertalarna, den art som ligger närmast moderna människor, försvann för cirka 30 000 år sedan, och mer spekulationer än fakta omger deras genetiska förhållande till oss. Även om Pääbo hade gjort några tidigare studier med neandertal-DNA, hade allt utöver rudimentär analys visat sig vara för svårt och kostsamt. Problemet är att under tusentals år har de få kända proverna av neandertal-DNA från fossiler degraderats till korta fragment på cirka 50 till 75 baspar. Dessutom är DNA:t ofta förorenat med genetiskt material från mikroorganismer och de moderna människorna som har hanterat fossilerna. Men Rothberg trodde att 454-maskinen kunde analysera många korta sekvenser till låg kostnad och generera tillräckligt med information för att låta forskare sålla gamla skatter från skräp. Rothberg kallade Pääbo, som gick med på att samarbeta.

Efter att ha sekvenserat gener från 70 ben- och tandprover från neandertalaren hittade Pääbos team och forskare från 454 ett prov, som uppskattas vara 38 000 år gammalt, som till största delen hade rent DNA. Som de rapporterade i en tidning som publicerades i höstas Natur , sekvenserade de sedan en miljon baspar från mindre än 200 milligram material, en prestation som har gett ledtrådar om huruvida moderna människor och neandertalare korsades och när de två arterna divergerade från varandra. Ännu viktigare, uppsatsen visar att det är möjligt att sekvensera alla tre miljarder baser i neandertalgenomet. Att göra det kan hjälpa till att lösa sådana mysterier som om neandertalarna hade den genetiska förmågan att tala.

Att reda ut huruvida människor och neandertalare korsade sig eller ens hade förmågan att prata med varandra kan få mycket uppmärksamhet i pressen och allmänheten, men andra tillämpningar för ultrasnabb DNA-sekvensering kan ha en mycket större inverkan på medicinen och på våra liv. Den traditionella sekvenseringsmetoden tittar på DNA från många olika celler. Men om en av dessa celler är, säg, en tumörcell, kan dess sekvens skilja sig något från de friska cellerna. I sådana fall väljer datorerna den sekvens som oftast hittas och kasserar de andra. Nästa generations sekvenserare som de som marknadsförs av 454 klonar och sekvenserar istället enstaka molekyler av DNA, vilket möjliggör ultradjup sondering som kan upptäcka sällsynta varianter. (Traditionella sekvenserare kan också analysera enstaka molekyler, men det är oöverkomligt dyrt.) Konsekvenserna av sekvensering av en enda molekyl är enorma för medicin. Även om det inte är praktiskt att använda konventionell sekvensering för att sniffa upp DNA-skillnaderna mellan friska och sjuka celler, kan de nya maskinerna enkelt utföra sådana experiment.

Matthew Meyerson, en klinisk patolog vid Dana-Farber Cancer Institute i Boston, har publicerat en studie som visar hur 454-maskinen kan hjälpa till att avslöja mutationer kopplade till lungcancer. Lungcancerläkemedel som nu finns tillgängliga riktar sig mot genen som Meyerson sekvenserar, och han hoppas att läkare i slutändan kommer att få bättre koll på vem som kommer att svara på vilka läkemedel genom att lära sig om patienten har en viss mutation. Jag föreställer mig att om några år kommer alla cancerpatienter att få sina tumörer kännetecknade av singelmolekylsekvensering om tekniken fortsätter att minska i kostnad, säger han.

I en variant av detta tema har Michael Kozal, en AIDS-kliniker vid Yale, gått med 454 för att göra ultradjup sekvensering av HIV för att fastställa förekomsten av mindre populationer av läkemedelsresistenta virus. Tidiga tester av tekniken hos patienter upptäckte ungefär dubbelt så mycket resistent HIV som Sanger-sekvensering gjorde. Även denna information skulle kunna hjälpa läkare att individualisera behandlingsregimer, vilket skulle öka kostnadseffektiviteten. Det är praktiskt att göra i vårt system, säger 454:s chefsforskare Michael Egholm, som samarbetar med Kozal. Förut var det helt enkelt inte överkomligt.

MyGenome
George Church, en pionjär inom sekvensering vid Harvard Medical School, säger att kostnaden är nyckeln. När priserna faller under de närmaste åren, säger han, kommer dessa maskiner att bli en demokratiserande kraft som kommer att göra traditionella sequencers nästan föråldrade, ungefär som persondatorer förflyttade stordatorer. Och detta kommer att leda till applikationer som ingen ännu kan förstå. Om vi ​​fortfarande arbetade med stordatorer skulle det inte hända många coola saker, säger han.

Church, som var bland de dussin forskare som föreslog Human Genome Project i mitten av 1980-talet, är en av få biologer vars labbutrustning inkluderar ett bordsmonterat skruvstäd och en borrpress. Han använder utrustning som denna för att bygga sina egna nästa generations sequencers, av vilka hans labb för närvarande har åtta (se TR35, september/oktober 2006) . Han är övertygad om att företag tar för mycket betalt för sina maskiner och vill fritt dela med sig av sin kunskap till alla intresserade kollegor. Han jämför sin filosofi med wiki- och Linux-mentaliteten och säger: Om ett gäng myror samlas kan de flytta en växt av gummiträd.

Churchs stora vision är att kanalisera den billiga floden av As, Cs, Ts och Gs till vad han kallar Personal Genome Project. I Human Genome Project fick forskare DNA från flera personer, som var och en av integritetsskäl förblir anonym. Så den slutliga sekvensen representerar en sammansatt person med ett konglomerat av olika genetiska bakgrunder och medicinska historia. Kyrkan vill att hans personliga genomprojekt ska avkoda DNA från individer, som också frivilligt kommer att lämna sina journaler. Han kommer att lägga upp alla resulterande uppgifter på Internet. I slutändan, föreställer han sig, kommer miljontals människor att gå med i projektet, lägga ut sina sekvenser, medicinska journaler och, om de så vill, även ansiktsfotografier online. Hela världen kommer då att ha tillgång till all data den behöver för att fritt testa hypoteser.

Även om kyrkan har fått avsevärd finansiering från National Institutes of Health för att utveckla sekvenseringsteknologi, har de etiska, juridiska och sociala frågorna som väckts av det personliga Genome Project hindrat NIH från att stödja det, trots en positiv granskning av en bidragsansökan i augusti 2005. Så fort jag fick godkännande blev NIH upphetsad, och inte nödvändigtvis på ett bra sätt, säger han. Han har försökt ta itu med integritets- och konfidentialitetsfrågorna och noterat att ingens identitet behöver offentliggöras och att NIH redan finansierar humangenetikprojekt som har färre skyddsåtgärder på plats.

Kyrkan inser att intim kunskap om sitt eget DNA kan vara för mycket för många människor. Du låter inte dina barn surfa på internetpornografisajter, säger han, och i viss mån tillåter du inte dig själv att surfa på de läskigaste och grymaste sajterna. Han förväntar sig att snarare än att få tillgång till deras råa genom, kommer människor att ha proffs som hjälper dem att tolka informationen.

Trots bristen på federal finansiering och de etiska invändningarna går kyrkan vidare, övertygad om att framsteg inom sekvenseringsteknologi kommer att driva idén om ett personligt genomprojekt framåt – precis som framstegen inom informationsteknologin har fått främlingar att dela data på ett sätt som ingen drömt om. när den dubbla diskettenheten Apple II debuterade för 30 år sedan. När sekvenserare blir effektivare, tror han, och kostnaderna fortsätter att sjunka, kommer personlig genomik att ta fart i en skala som få människor ännu har föreställt sig.

Vinner på lotteriet
I oktober förra året tillkännagav X Prize Foundation ett pris på 10 miljoner dollar för att producera mycket exakta sekvenser av 100 mänskliga genom på 10 dagar eller mindre utan att spendera mer än 10 000 dollar per genom. En av de första deltagare var 454, som planerar att utveckla ännu mindre pärlor som man hoppas ska göra det möjligt för sina maskiner att läsa ännu mer DNA per körning till ungefär samma kostnad. Vi behöver ingen ny fysik eller matematik för att komma till genomet på 1 000 dollar, säger Rothberg.

Bortsett från frågan om när – eller om – någon kommer att göra anspråk på X-priset, kommer DNA-sekvensering säkert att fortsätta att rasa i pris och öka i noggrannhet. Fram till förra året kämpade sekvensering verkligen för att få den inverkan på nästa era av genomik som den behövde ha, säger David Bentley, Illuminas chefsforskare. I grund och botten föll priset på traditionell sekvensering inte tillräckligt snabbt. Nu är fältet mycket mer optimistiskt än det var, säger han. Nästa generations sekvensering har en enorm roll att spela.

Att höra forskare bocka av möjligheterna är som att lyssna på lottovinnare. Och personlig medicin som den typ av cancertestning och behandling som Dana-Farbers Meyerson hoppas kunna hjälpa till med är bara en startpunkt. Bentley säger att de nya sekvenserarna kommer att öppna fönster på de stora icke-kodande regionerna i genomet som slår på och av gener. Egholm av 454 noterar att Human Genome Project inte faktiskt sekvenserade varenda bit av mänskligt DNA; det kan fortfarande finnas oupptäckta gener som ytterligare sekvensering kan hitta. Broad's Lander föreställer sig en ström av ny information om vad som får en cell att differentiera till en eller annan typ (ett centralt mysterium inom utvecklingsbiologi) och vad som styr olika celltillstånd. Jag inser att det är svårare att förklara än att bota cancer, säger han, men det är i slutändan viktigare, eftersom det kommer att påverka alla sjukdomar.

Inom nästa år, förutspår Lander, kommer forskare att kunna påbörja studier som genererar terabaser av information - en biljon As, Cs, Ts och Gs. Jag har aldrig ens sagt ordet terabas innan förra året, säger han. Och om alla dessa data finns på webben och fritt tillgängliga, kommer det att driva en helt annan typ av biologi.

Jon Cohen, en San Diego-baserad frilansskribent och korrespondent för Vetenskap , arbetar på en bok som tittar på de genetiska skillnaderna som skiljer schimpanser från människor.

Dölj