Sekvensering av en enskild DNA-molekyl

I hörnet av Helicos BioSciences kontor i Cambridge, MA, blinkar en skärm på framsidan av vad som ser ut som ett gigantiskt kylskåp en nedräkning: 10 dagar, fem timmar och 51 minuter tills den har läst klart sekvensen av allt DNA som har matats in i den. Maskinen med hög genomströmning, en komplex konfiguration av rör, lasrar och kemikalier, innehåller två plattor, var och en med 25 mikrofluidkanaler etsade in i den. Varje kanal kan hålla och sekvensera ett separat DNA-prov. Genom att sekvensera proverna parallellt tar det bara en timme att läsa av 1,3 miljarder av de kemiska baserna – kända som A, C, T och G – som utgör en DNA-sträng.

HeliScope är den första kommersiella maskinen som sekvenserar en enskild DNA-bit istället för en som kopierats många gånger. Varje flödescell (ovan) har 25 kanaler, var och en kan hålla 16 miljoner DNA-strängar för sekvensering. En beläggning på ytan av cellen gör att den kan tvättas ren mellan reaktionerna.

Kallas HeliScope, det är det första kommersiella instrumentet som direkt kan läsa sekvensen av en enda sådan sträng, en förmåga som ger den potential för oöverträffad hastighet. Faktum är att, säger Stephen Quake, en bioingenjör vid Stanford University som var med och grundade företaget 2003, Helicos har i princip byggt världens snabbaste DNA-sekvenserare. Även om det inte är klart om maskinen kommer att producera en komplett sekvens snabbare än konkurrerande system gör (data som genereras av en sekvenseringsmaskin måste fortfarande analyseras och sys ihop, en beräkningsintensiv uppgift), säger Quake att den öppnar helt nya områden av forskning.

Den här historien var en del av vårt julinummer 2008

• Se resten av frågan
• Prenumerera

HeliScope, som introducerades tidigare i år, går med i ett intensivt lopp för snabbare och billigare sekvenseringsteknologier. Priset för att sekvensera ett mänskligt genom har sjunkit de senaste åren, från de 300 miljoner dollar som Human Genome Project spenderade på sitt första utkast till mindre än 100 000 dollar. Tillämpningarna av billig sekvensering är nästan obegränsade, från sjukdomsdiagnostik till forskning som kan ge mikrober konstruerade för att producera biobränslen eller mediciner.

I andra avancerade sekvenseringsteknologier som för närvarande används, inklusive de från Illumina, Applied Biosystems och 454 Life Sciences (som förvärvades av Roche förra året), måste DNA:t som ska sekvenseras amplifieras eller kopieras många gånger; kopiorna läses sedan samtidigt för att göra det lättare att upptäcka fluorescerande signaler som indikerar positionen för varje DNA-bokstav. Enkelmolekylsekvensering hoppar över kopieringssteget, vilket innebär att många fler unika prover kan packas i ett enda sekvenseringsexperiment.

Multimedia

• Se Helicos Biosciences process för att sekvensera en enskild DNA-molekyl.

• Stephen Quake, medgrundare av Helicos Biosciences, pratar om sekvensering.

Dessutom kan sekvensering av en enda molekyl kunna generera en mer komplett bild av genomet. Det beror på att när DNA amplifieras är det mer sannolikt att vissa strängar än andra kommer att kopieras framgångsrikt, så det är mer troligt att de representeras i den slutliga sekvensen. På samma sätt kan sällsynta genetiska mutationer förbli orepresenterade eftersom de inte kopieras. Om du i slutet av dagen bara kan lägga en enda DNA-sträng på en plattform och sekvensera den direkt, är det en stor fördel, säger Elaine R. Mardis, meddirektör för Genome Center vid Washington University i St. Louis.

Vaken på natten
Med Helicos-teknologin, hackas DNA som ska sekvenseras först i korta bitar som är cirka 200 baser långa och injiceras i en flödescell, en specialiserad glasskiva. Flödescellen är belagd med små bitar av DNA som är utformade för att haka fast fragmenten när de flyter förbi, förankrar dem på plats. De immobiliserade bitarna av DNA är fluorescerande märkta så att deras position under ett fluorescensmikroskop kan registreras med en kamera. Nästan en miljard bitar av DNA kan analyseras i ett enda sekvenseringsexperiment, jämfört med cirka 400 000 till 50 miljoner för andra teknologier.

Flödescellen är sedan inbäddad i HeliScope, där mikroskopet sitter inbäddat i 400 pund Vermont-granit. Den extra vikten hindrar alla vibrationer från att störa signalerna som enheten måste upptäcka. Ett komplext optiskt system och en härva av slangar omger mikroskopet och kopplar det till något som ser ut som ett miniatyrkylskåp fyllt med flaskor med specialgjorda kemikalier.

När en vetenskapsman aktiverar maskinen börjar en exakt koreograferad dans av vätskor. Ett enzym som kallas DNA-polymeras och en enda typ av fluorescensmärkt bas – till exempel A – strömmar in i cellen. Enzymet får de As att ta plats i växande DNA-strängar som kompletterar strängarna i proverna. (Var och en av de fyra baserna kan paras ihop med endast en annan bas, så ett tillagt A måste ställas mittemot ett befintligt T och ett C mot ett G.) När den fluorescerande märkta basen är införlivad i den nya strängen, kan HeliScopes kamera upptäcka ljuset den avger. Avbildaren upptäcker en plym – en 200 nanometers kon av ljus – från integrationen av en enda [bas] på en enda DNA-sträng, säger Steve Lombardi, ordförande för Helicos.

Andra avancerade sekvenseringsmetoder använder en liknande metod, känd som sekvensering genom syntes. Men till skillnad från dessa teknologier kan HeliScope särskilja den oförstärkta fluorescerande signalen från en enda bas som tar sin plats på en växande DNA-sträng. En nyckel till den förmågan är ett nonstick-material som företaget utvecklat, som täcker ytan på flödescellen och gör att den kan tvättas ren mellan reaktionerna: kvarvarande fluorescerande baser skulle göra det svårare att exakt detektera individuella sekvenseringsreaktioner. Du måste se till att inga extra basmolekyler fastnar på ytan, säger Patrice Milos, vetenskapschef på Helicos. Detta var en av de största tidiga utmaningarna. Efter varje cykel klipps de fluorescerande markörerna från de nyligen införlivade baserna och återstående kemikalier tvättas bort. Processen upprepas sekventiellt med var och en av de fyra baserna.

HeliScope genererar en enorm mängd rådata varje sekund. Det tar fem till tio dagar att läsa av allt DNA som kan laddas in i två flödesceller; för sekvensering är det 400 miljoner DNA-strängar per cell, vilket kan generera en användbar sekvens för 20 miljarder baser. Forskare laddar maskinen, trycker på en knapp i ansiktet och går. Men den sekvensbesatta kan använda Internet för att kontrollera maskinens framsteg mitt i natten, en vanlig händelse på Helicos.

När HeliScope väl har skapat sin serie av fluorescensfotografier omvandlar ett medföljande databehandlingscenter dem till bokstäver. Programvara klistrar ihop dessa bitar för att bilda en längre sekvens.

Saknade mutationer
I en tidning publicerad i Vetenskap tidigare i år rapporterade forskare om deras användning av HeliScope för att sekvensera genomet av M13-viruset, ett viktigt bevis på att sekvensering av en molekyl kan användas för att läsa och sammanställa sekvensen av ett komplett genom. (Omkring 7 000 baspar långa, M13-virusets genom är litet – ungefär en miljondel av en människas.) Tekniken är så ny att det ännu inte är klart vilka applikationer den kommer att vara bäst lämpad för. Men vissa forskare tror att sekvensering av en molekyl kan vara särskilt viktig för att förstå hur genetiska variationer bidrar till sjukdom. När allt kommer omkring kan vissa sällsynta mutationer kopplade till sjukdom ha missats i tidigare genomiska studier eftersom de inte kopierades under amplifieringsprocessen.

Helicos pysslar fortfarande med tekniken och utvecklar kemi som kan öka hastigheten på sekvenseringsreaktionerna och tillåta att fler bitar av DNA förankras i en flödescell. Tillsammans med de andra stora aktörerna på området hoppas företaget kunna leverera en komplett genomsekvens för $1 000, en prestation som skulle markera början på något helt nytt inom medicin: individers förmåga att få tillgång till sin egen genomisk information.

Emily Singer är BARN redaktör för bioteknik och biovetenskap.

Dölj