Receptbelagt RNA

Det är champagne för alla. Phil Zamore tar upp korken från en flaska Montaudon och dränker den helt nya mattan. Alla i hans labb fyller ett glas för att skåla för chefen. Oväntade goda nyheter, förklarar han. Zamore, en biokemist vid University of Massachusetts Medical School i Worcester, har precis fått ett nationellt pris värt 1 miljon dollar under fem år. Labbets budget har precis tredubblats.

Zamore är förståeligt nog snurrig, och det handlar inte bara om pengarna. Zamores område, RNA-interferens, eller RNAi, är bara några år gammalt, men det har tagit biologins värld med storm. RNAi är den mest spännande insikten inom biologi under det senaste decenniet eller två, säger nobelpristagaren Phillip Sharp, biolog vid MIT. Och Zamores labb är ett av en handfull som flyttar fältet framåt i en svindlande takt. Jag tror att alla som jobbar på fältet känner sig lite andfådda av framstegen, säger Zamore.

Den här historien var en del av vårt decembernummer 2002

• Se resten av frågan
• Prenumerera

Känslan av spänning som delas av Zamore, Sharp och andra forskare är välgrundad. I decennier trodde forskare att RNA bara var DNA:s budbärare, som slaviskt levererade DNA:s proteinritningar. Men det verkar nu som att små dubbla RNA-strängar, som introduceras i laboratorieodlade celler eller djur, snabbt och effektivt kan stänga av vilken gen som helst.

Konsekvenserna är hisnande, eftersom levande organismer till stor del definieras av den utsökt orkestrerade på- och avkopplingen av gener. Biologer har hittills bara kunnat efterlikna denna växlingsprocess på ett långsamt, tungt och indirekt sätt. Men den lätthet med vilken RNAi kan stänga av gener, säger forskare, verkar nästan mystisk. Laboratorietekniker som använder RNAi är redan biologers valda metoder för att upptäcka funktionerna hos särskilda gener. Och det lovar ett nytt sätt att behandla sjukdomar direkt genom att stänga av nyckelgener som är involverade i olika åkommor. Redan nu arbetar minst åtta företag – inklusive ett grundat av Zamore, Sharp och kollegor – med RNAi-terapier för allt från virussjukdomar till cancer.

Den heliga gralen ska utveckla allt detta till droger, säger Zamore. För att kunna ge dig ett litet störande RNA som skulle stänga av uttrycket av din högkolesterolgen. Det skulle sänka nivån av hepatit C som infekterar din lever. Eller kanske, tror jag, i den kanske största applikationen 'paj-i-himlen', som skulle skärpa in på en gen som är specifik för tumörceller och döda tumören.

Hur snart detta kan hända är någons gissning. RNA-interferens bröt in i den vetenskapliga världens medvetande vid det årliga mötet för RNA Society i Banff, Alberta, i maj 2001. Där, Sayda Elbashir, en postdoc i labbet hos biokemisten Thomas Tuschl vid Max Planck Institute for Biophysical Chemistry i Gttingen, Tyskland, förbluffade sina lyssnare med nyheten att små dubbelsträngade RNA-fragment snabbt, enkelt och specifikt stängde av gener i mänskliga celler, en roll som forskare aldrig tidigare sett RNA spela.

De flesta av publiken satt bara där och sa till sig själva: Vetenskapen har precis förändrats, minns biokemisten David Engelke vid University of Michigan. Det enda som förhindrade pandemonium var att vi hade blivit lovade sånt här tidigare. Skeptisk väntade Engelke några månader. Sedan började dessa rapporter trilla in: Jösses, det här fungerar verkligen!’

RNA-överraskningen

Tills nyligen var den ganska oglamorösa roll biologer hade tillskrivit RNA den som en passiv budbärare, som levererar genetisk information från DNA till cellens proteintillverkningsmaskineri. I denna process transkriberas en gens DNA-kod till en RNA-kopia, som cellmaskineriet översätter till ett protein. Vid RNA-interferens blockerar korta bitar av RNA processen genom att förstöra meddelandet på vägen. De dubbelsträngade RNA-fragmenten leder skärande enzymer till det RNA som bär det genetiska budskapet. Budbärar-RNA:t hackas sedan upp och markeras för destruktion: genens budskap tystas effektivt.

Biologer har vetat i åratal att enkelsträngade RNA-molekyler utformade för att paras ihop med ett budbärar-RNA kan stänga av proteinproduktionen, men denna konstgjorda process är opålitlig även i labbet. Naturen reglerar dock gener med RNA, specifikt dubbelsträngade molekyler.

De första antydningarna om fenomenet dök upp redan 1990, men på den tiden kopplade forskarna inte det de hade observerat med RNA. Det året försökte växtbiologen Rich Jorgensen, då vid DNA Plant Technology i Oakland, Kalifornien, göra lila petunior till en djupare nyans av lila. Han satte in en ny, överladdad kopia av genen som styr produktionen av lila pigment. Till sin förvåning fick han vita petunior. Jorgensen insåg vikten av denna paradoxala effekt, men han kunde inte förklara varför tillsatsen av mer av en gen hade stängt av den genen.

Nästa ledtråd kom 1995, när genetiker vid Cornell University klonade en gen i den mikroskopiska jordmasken C. elegans . För att verifiera sin upptäckt använde de en standardlabbmetod för att stänga av genen: de lade till en enda RNA-sträng som matchade budbärar-RNA:t. Denna komplementära sträng band till budbäraren, vilket hindrade den från att översättas till ett protein. Oväntat stängde också en icke-komplementär enkelsträng av RNA som de använde som en experimentell kontroll och som inte borde ha gjort något, genen.

1998 löste biokemisten Andrew Fire, då vid Carnegie Institution of Washington, och genetikern Craig Mello, vid University of Massachusetts Medical School, mysteriet. Genom att injicera kompletterande enkla RNA-strängar i maskar fick de en häpnadsväckande kraftfull tystande effekt när de två strängarna kombinerades. Efter att ha visat att dubbelsträngat RNA var det verkliga ljuddämpningsmedlet, myntade Fire och Mello termen RNA-interferens, och ett nytt fält föddes. I efterhand gav Jorgensens överladdade lila gener dubbelsträngade RNA som hade samma effekt på de inhemska lila generna, vilket i huvudsak stängde av dem.

Det dubbelsträngade RNA:t verkade ge ett mer stabilt och tillförlitligt sätt att stänga av specifika gener än de enkla strängarna, och laboratorier som studerade organismer inklusive växter, maskar och flugor anammade ivrigt den nya metoden. RNA-interferens fungerade dock inte hos däggdjur: immunsystemet förstör celler som innehåller dubbelsträngat RNA för att försvara sig mot RNA-virus som de som orsakar hepatit A och C. Sedan kom Tuschl och Elbashirs uppenbarelse i Banff att mycket korta RNA-segment, som de kallade litet störande RNA, fungerade i mänskliga celler. Vid det laget, säger Sharp, tog hela fältet fart.

Tyst behandling

Nu letar utredare efter sätt att omvandla denna kraftfulla nya roll för RNA till företagsvinster. Så gott som alla läkemedelsföretag använder redan RNA-interferens som ett verktyg för läkemedelsupptäckt. En av de mest populära strategierna för att hitta nya läkemedelsmål involverar att slå ut eller inaktivera gener en efter en för att se vad som händer. Om till exempel ett sjukt djur kan botas genom att slå ut en viss gen, kan den genens protein bli ett bra läkemedelsmål. Att använda små störande RNA, visar det sig, kan radikalt påskynda denna process. Istället för att spendera månader eller år för att konstruera en knockout, använder forskare RNA för att specifikt och snabbt stänga av en gen. De kan också observera om avstängning av proteinet - som ett läkemedel skulle - orsakar biverkningar. Processen sker inom några dagar, istället för ett år, säger Christophe Echeverri, VD för Cenix BioScience, ett bioteknikföretag i Dresden, Tyskland.

I den ultimata tillämpningen kan små störande RNA i sig vara droger: snarare än att blockera ett visst protein, som standardläkemedel gör, skulle RNAi förhindra att proteinet någonsin tillverkas. I juni förra året visade MIT:s Sharp att sådana RNA, riktade mot viktiga virala och mänskliga gener, kunde stoppa HIV-infektion i celler som odlas i labbet. I ett experiment blandade forskarna HIV-infekterade celler med små störande RNA:n riktade mot virala gener. RNA stoppade viral reproduktion. Sharps grupp blandade också oinfekterade celler med små störande RNA:n riktade mot CD4, ett protein på ytan av celler genom vilket HIV tar sig in. Forskarna visade att RNA minskade produktionen av CD4. Två och en halv dag senare exponerade de RNA-behandlade celler och obehandlade celler för HIV. Viruset infekterade fyra gånger så många obehandlade celler.

Trots de uppmuntrande resultaten är RNAi-läkemedel för närvarande fortfarande i drömstadiet, säger Sharp. Men Sharp ansåg att det tidiga löftet var tillräckligt lockande för att tillsammans med Zamore, Tuschl och två andra forskare - Alnylam Pharmaceuticals i Cambridge, MA, utveckla sådana läkemedel. Företaget var knappt igång när det säkrade 17 miljoner dollar i riskkapitalfinansiering i juli förra året.

Att göra RNAi-läkemedel kommer dock inte att vara lätt. För det första har ingen hittat metoder som är lämpliga för att administrera RNA till människor. Det finns ett leveransproblem. Så enkelt är det, säger Harvard University kemist Stuart Schreiber. Att få nukleinsyror till sina målvävnader [är] ett olöst problem inom medicinen. RNAi-terapi är i grunden genterapi, säger Schreiber, och den kommer att möta samma problem - ineffektivitet, ineffektivitet och immunologiska biverkningar - som har stoppat det området sedan 1999, när Jesse Gelsinger dog under en genterapiförsök vid University of Pennsylvania. Läkare där använde modifierade virus som transportmedel, eller vektorer, för att transportera DNA in i tonåringens celler. Gelsingers immunsystem svarade massivt och dödligt.

Sharp säger att förhoppningen är att små störande RNA kanske inte behöver vektorer för att nå sitt mål, och därmed undviker de flesta fallgropar som är förknippade med DNA-baserad genterapi. Men det scenariot är långt ifrån säkert. Kan du modifiera RNA för att göra dem mer stabila [och] för att få dem att tas upp mer effektivt av celler? frågar Sharp. Vi vet inte.

Making Sense

Nyare biomedicinsk historia hjälper inte till att lösa osäkerheten. Faktum är att detta inte är första gången forskare har försökt göra ett läkemedel baserat på att tysta RNA. Enkelsträngat antisens-RNA eller DNA kan också stänga av gener - och behöver ingen vektor. Inuti cellen hittar en antisens-molekyl sitt komplementära budbärar-RNA och, som två sidor av en dragkedja, binder de tätt, vilket hindrar budbärar-RNA från att gå igenom cellens proteintillverkningsmaskineri. Resultatet, åtminstone i teorin, är genavstängning.

Antisense har dock hittills varit en besvikelse som grund för nya läkemedel. Efter mer än ett decennium av intensivt utvecklingsarbete har bara ett antisens-läkemedel - Isis Pharmaceuticals' Vitravene, för behandling av vissa sällsynta ögoninfektioner hos AIDS-patienter - vunnit Food and Drug Administration-godkännande. Den första generationen av antisensläkemedel, som testades i början av 1990-talet, bröts snabbt ned i kroppen, var svåra att få in i cellerna, lyckades ofta inte hitta sitt mål och orsakade allvarliga biverkningar. Mer stabila antisensläkemedel testas nu på människor.

Kan RNAi göra bättre än antisense? Inte när som helst snart, förutspår Frank Bennett, vicepresident för antisensforskning på Isis. Om man jämför RNAi med den nuvarande versionen av antisense är det verkligen ingen fördel, säger han. [Liten störande] RNA-teknik är verkligen i sin linda. Det motsvarar ungefär där antisens var för 10 år sedan, när vi precis började göra experiment på djur.

Men RNAi-människor ser sin teknologi som fundamentalt annorlunda än antisens. Den stora fördelen med RNAi framför antisense är att det här faktiskt fungerar verkligen, säger Cenix VD Echeverri. RNAi, säger han, är mycket mer potent och pålitlig än antisense. Antisenseprojekt sågs vanligtvis som självmordsprojekt, säger han. Du kan lägga mycket tid på att få det att fungera, och det skulle aldrig fungera. Du skulle inte ha något att visa. RNAis större styrka, tror Echeverri, borde ge bättre terapier. Och eftersom mindre läkemedel kommer att behövas för att tysta en gen, borde det finnas färre biverkningar.

Människor har kämpat med antisens, och här kommer en teknik som verkligen fungerar, instämmer Jon Wolff, chief scientific officer för Mirus, ett RNA-terapiföretag i Madison, WI. Antisense är svårt att reproducera, men RNAi är något som fungerar direkt ur fatet.

Men kan RNAi bara vara ännu en överhypad teknologi? Beviset finns i puddingen, säger Echeverri. Under de senaste två, tre åren har RNAi precis tagit över. Alla vänder sig till det; i varje organism de försöker det. Och det skulle inte vara så populärt om det inte var framgångsrikt.

Tysta tvivel

Ingen har ännu provat RNAi på människor, men ett företag är nära: Ribopharma, en biotech-startup i Kulmbach, Tyskland. Mer än ett år innan Tuschls grupp chockade det vetenskapliga samfundet med sina nyheter, upptäckte Ribopharmas grundare, före detta Bayreuth University-lektorerna Roland Kreutzer och Stefan Limmer, att små RNA:n fungerade i däggdjursceller. Eller så hävdar Kreutzer och Limmer. De har aldrig publicerat sina uppgifter.

Kreutzer och Limmer resonerade att det var fysiskt omöjligt för mycket långa RNA, som de som används av Fire och Mello, att binda alla på en gång till sina mål-RNA. Endast korta segment skulle fastna. Så de försökte tysta däggdjursgener med RNA kort nog för att undvika det dödliga immunsvaret. Det var hasardspel, säger Limmer. Och det visade sig att det verkligen fungerar. Forskarna lämnade in en patentansökan, slutade sina lärarjobb och grundade i juni 2000 Ribopharma.

Ribopharmas huvudmän planerar att påbörja försök på människor nästa år, troligtvis med tester av små störande RNA:er i behandlingen av malignt melanom och pankreascancer. Kreutzer och Limmer säger att deras RNA-konstruktioner är tillräckligt stabila för att fungera utan vektorer och kan injiceras direkt i tumörstället eller i blodomloppet. Företaget har samlat in mer än 18 miljoner dollar. Men eftersom Ribopharma ännu inte har publicerat sina resultat är det svårt att utvärdera dess påståenden, säger andra RNA-forskare. De har gjort en del saker, säger MIT:s Sharp, ganska trevligt...[Men] det är en lång väg.

Hur länge? Attityder sträcker sig från Ribopharmas goda försäkringar till stark pessimism. David Beach, VD för RNAi-startupen Genetica i Cambridge, MA, pekar på antisenses årtionde plus odyssé. Jag vill inte sitta och argumentera för att distribuera RNAi i ett terapeutiskt läge skulle vara enklare, säger han.

Vad som är mycket tydligare är att RNAi tvingar biologer att ompröva RNA:s roll. Under de senaste åren har forskare hittat hundratals gener som kodar för små RNA-molekyler, kallade mikroRNA, i organismer allt från växter och maskar till människor. Liksom deras små störande RNA-kusiner verkar mikroRNA tysta gener, men deras roll i biologin är mestadels okänd. Många av dem har varit mycket högt bevarade under evolutionens gång; [så] de måste göra något viktigt, säger MIT-biologen David Bartel. Samtidigt har insikten att RNAi är en naturlig och förmodligen grundläggande process i växter och djur hjälpt till att göra det till ett av de mest spännande mysterierna i dagens biologi.

Små RNA-gener kan vara den biologiska motsvarigheten till mörk materia - överallt omkring oss men nästan undslipper upptäckt, skrev Gary Ruvkun, en molekylärbiolog vid Harvard Medical School, 2001 i tidskriften Vetenskap . Vad gör dessa mystiska gener? Jag misstänker att det vi tittar på är en mycket gammal metod för att kontrollera genuttryck, säger Zamore.

Om mikroRNA är switchar som avgör om stamceller blir neuroner eller muskler, eller om cancerceller växer eller dör, så är RNA-interferens mycket viktigare än någon trodde för bara några år sedan. Vi snubblade helt enkelt över en helt ny gren av molekylärbiologi som vi inte visste om tidigare, säger Michigans Engelke.

För optimisterna visar dessa genombrott en snabb utveckling av effektiva läkemedel. Och även biomedicinska forskare som gjorts cyniska av extravaganta påståenden om magiska botemedel tror att RNAi bara kan vara den äkta varan. Förra året, när RNAi först arbetade i mänskliga celler, vaknade alla och sa: Jag undrar om det här är silverkulan?, säger Engelke. Och det kan det vara. Det kan vara.

Företag som utvecklar RNA-interferens FÖRETAG PRIMÄRT RNAi FOKUS Alnylam Pharmaceuticals
(Cambridge, MA)
Terapeutik Benitec
(Brisbane, Australien)
Immateriella rättigheter för genomik och terapi Cenix BioScience
(Dresden, Tyskland)
Identifiering av läkemedelsmål och behandlingar för cancer Devgen
(Gent, Belgien) Identifiering av läkemedelsmål och behandlingar för diabetes, depression och Parkinsons sjukdom Genetik
(Cambridge, MA)
Läkemedelsmålidentifiering för cancer Mirus
(Madison, WI)
Terapeutik med lång dubbelsträngat RNA ribopharma
(Kulmbach, Tyskland) Terapeutika för cancer och hepatit C

Dölj