211service.com
Lyser upp celler i 3D
En revolution inom ljusmikroskopi låter forskare zooma in på strukturer som aldrig tidigare visualiserats med synligt ljus. Nya tekniker för superupplösningsmikroskopi under utveckling i flera laboratorier gör det möjligt för forskare att se strukturer som en gång var för små för att kunna ses i ett ljusmikroskop, på grund av den inneboende upplösningsgränsen som ljusets våglängd påför.
Med en teknik som kallas PALM kan Harald Hess och kollegor peka ut positionerna för många olika membranproteiner i två dimensioner.
Forskare vid Howard Hughes Medical Institutes Janelia Farm Research Campus tillkännagav nyligen skapandet av en teknik som kallas interferometrisk fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (iPALM), som tillåter dem att skapa tredimensionella bilder av strukturer inuti celler med den högsta upplösningen som hittills setts med ett optiskt mikroskop.
Tekniken, detaljer om vilken publicerades nyligen i Proceedings of the National Academy of Sciences , lägger till en tredje dimension till ett tidigare tillvägagångssätt som kallas PALM, som använder fluorescerande molekyler som kan slås på och av för att lösa detaljerna i små strukturer under ett ljusmikroskop. Med PALM slås endast en liten del av de fluorescerande molekylerna inuti en cell på vid varje given tidpunkt, vilket omvandlar en dis av ljus till en relativt gles uppsättning ljusa fläckar som kan lösas individuellt och som avslöjar positionen för proteiner taggade med fluorescerande molekyler. Genom att sy ihop många bilder skapar forskarna en komplett tvådimensionell bild.
För att lägga till en tredje dimension till PALM vände sig forskarna till interferometri, en teknik som används flitigt för att mäta vinklar och avstånd på mikroskopisk skala. Ljus från fluorescerande molekyler i provet fångas uppifrån och under, och de två ljusstrålarna skickas till en stråldelare som leder dem till tre olika kameror. Mängden ljus som når varje kamera kan användas för att beräkna den vertikala positionen för varje fluorescerande molekyl i provet. I slutändan kan vi få positionen i alla tre riktningarna av en molekyl på mindre än 20 nanometer, eller ungefär 10 gånger storleken på ett genomsnittligt protein, säger Harald Hess , Janelia Farm-forskaren som ledde studien. Klicka här för att se bilder av cellstrukturer skapade med iPALM.
John Sadat , professor i biokemi och biofysik vid University of California, San Francisco, säger att tidningen är en tour de force för att driva upplösningen av ljusmikroskop. Men han tillägger att en av avvägningarna med att använda så hög rumslig upplösning för biologisk avbildning är att det för närvarande kräver att celler dödas och fixeras kemiskt, så det kan inte fånga händelser i realtid. Utmaningen för fältet, säger Sedat, är att sammanföra framsteg inom rumslig upplösning med realtidsavbildning av levande celler.
Gleb Shtengel, en av ledarna för den nya tekniken, säger att även om tiden som krävs för att kombinera flera bilder gör det svårt att fånga snabba händelser med iPALM, planerar vi att utöka den till levande cellbilder av händelser som rör sig långsammare.