211service.com
Ingenjörsmikrobiella världar
En familjeförlust intensifierade Cullen Buies intresse för bakterier – och att utnyttja dem för gott. 25 april 2018
Cody O'Laughlin
Av världens otaliga arter av bakterier (uppskattningar sträcker sig från miljoner till miljarder, beroende på vem du frågar), har forskare identifierat och katalogiserat endast cirka 20 000. Och bland dessa arter har färre än 1 procent utsatts för den typ av mixtrande som kan hjälpa forskare inom det blomstrande området genteknik att anpassa dem för otaliga mänskliga syften.
Det finns bara så mycket vi inte vet, säger Cullen Buie, den nyligen anställda Esther och Harold E. Edgerton Karriärutvecklingsprofessor i maskinteknik. Allt arbete görs på 1 procent av 1 procent. Vi skrapar bokstavligen bara på ytan.
Men potentialen är enorm: genom att ändra den genetiska koden för befintliga bakterier kan forskare inom en inte så avlägsen framtid kanske bygga mikroorganismer som kan göra saker som att behandla sjukdomar, skapa gödsel efter behov eller städa upp oljeutsläpp.
Det finns all denna motivation att försöka utnyttja den mikrobiella världen, och folk inser: 'Människa, vi är begränsade av våra verktyg', säger han. Så Buie använder sin mikrofluidikexpertis för att skapa enheter som han hoppas verkligen kan kasta ljus över alla typer av problem som de bara inte ens kunde titta på tidigare. Vid MIT leder han Laboratory for Energy and Microsystems Innovation (LEMI), som fokuserar på elektrokemi, mikrofluidik och bränslecellsforskning, mycket av det syftar till att hitta nya sätt att manipulera bakterier. Han har också varit med och grundat en startup som utvecklar ett mikrofluidiskt verktyg som dramatiskt kan accelerera takten inom genteknik.
Wow, det här är perfekt
Buie ville först inte studera bakterier. Som tonåring hade han tänkt satsa på medicin och följa i sin äldre syster Simones fotspår. Men att gå på ett ingenjörsläger för högskolan ledde honom till huvudämne i maskinteknik i Ohio State. Sedan, som National Science Foundation-forskare vid Stanford, fann han sig attraherad av förnybar energi – och till mikro- och nanoteknik. Så han gick med i labbet av professor i maskinteknik, Juan Santiago, som precis hade fått finansiering för ett projekt som bygger nanoskalapumpar för fordonsbränsleceller. Jag tänkte 'Wow, det här är perfekt. Det här är alternativ energi och mikroskalor på en gång, säger han.
Under Santiago fokuserade Buie på mikrofluidiska elektroosmotiska pumpar som använder elektriska fält för att reglera tryck och flödeshastighet. För sin avhandling utforskade han deras användning i lågtemperaturbränsleceller. I ett postdoktoralt stipendium vid University of California, Berkeley, vände Buie sin uppmärksamhet mot mikrobiella bränsleceller, som ofta används i biosensorer och reningsanläggningar för avloppsvatten. Mikrobiella bränsleceller innehåller bakterier fästa vid en elektrod. När de tillförs organiskt material från källor som avloppsvatten bryter bakterierna ner maten, vilket gör att elektroner kan utnyttjas för att skapa en elektrisk ström.
Ytegenskaper avgör om bakterier som strömmar genom en klämd mikrofluidkanal immobiliseras av vissa elektriska fält. Med tillstånd av Cullen Buie
Året därpå blev bakteriearbetet personligt. 2010, kort efter att han började på MIT-fakulteten som biträdande professor i maskinteknik, fick han ett telefonsamtal. Hans syster -Simone hade lagts in på ett sjukhus i Ohio tidigare samma dag med rasande feber, snabba hjärtslag och smärta. Hon dog timmar senare av sepsis, ett tillstånd som uppstår när kroppens försök att bekämpa vanliga bakterier som Staphylococcus aureus (staph) och Streptokocker utlösa inflammation som leder till organsvikt.
Buie var förkrossad. När han arbetade igenom sin sorg började han tänka på sin systers död ur ett vetenskapligt perspektiv. Det var lite chockerande för mig att folk fortfarande dog av bakterieinfektioner, säger han. Jag arbetade redan med mikrobiella bränsleceller, så när detta hände väckte det min nyfikenhet kring bakterier och alla de olika saker de kan göra, både bra och dåliga.
Vid den tiden började LEMI precis komma igång och dess första studenter och postdoktorer var på väg in på olika forskningsvägar. Ett projekt fokuserade på nya sätt att tillverka superhydrofila (vattenabsorberande) och superhydrofoba (vattenavstötande) ytor – tekniker som kan vara användbara inom marinteknik – medan ett annat fokuserade på att designa en ny typ av batteri som använder vätskedynamik för att behålla sina komponenter separat.
Det finns så mycket vi inte vet. Allt arbete görs på 1 procent av 1 procent. Vi skrapar bokstavligen bara på ytan.
Samtidigt fokuserade andra LEMI-forskare på att utveckla mikrofluidiska verktyg som skulle använda en process som kallas dielektrofores för att sortera bakterier enligt deras cellers elektriska egenskaper, som inkluderar polarisering, uppbyggnad av laddning på deras yta. För det här projektet använde Buies team mikrofluidkanaler med en bredd av cirka fem människohår, med flaskhalspunkter ungefär en tiondel av storleken i mitten. De tryckte bort celler Pseudomonas aeruginosa bakterier genom kanalerna och applicerade elektriska fält. När de ökade spänningen gled olika bakteriestammar genom kanalen medan andra stannade vid flaskhals , där det elektriska fältet var mest intensivt.
Exakt var en cell stannade - och hur intensivt det elektriska fältet var vid den tidpunkten - visade forskarna hur polariserad ytan på bakterien var, vilket gav ledtrådar om dess patogenicitet. Fler patogena stammar av Pseudomonas aeruginosa är mer benägna att polarisera vid lägre spänningar, vilket fick Buie att tro att forskningen skulle kunna användas för att hjälpa till att diagnostisera bakteriella tillstånd som sepsis i tid för att rädda liv.
Mer praktiska metoder fanns dock redan för att avgöra om bakterier är patogena. Nu fokuserar Buie på att använda dielektrofores för att koppla genetisk information till bakteriers fysiska egenskaper. Om till exempel gener slås ut ur en föga studerad bakteriestam, kan eventuella resulterande förändringar i polarisering ge information om vad som kan vara användbarheten av dessa gener eller vilket område av cellen de kan påverka, säger han.
Från utsidan och in
År 2013 hade Buie riktat sin uppmärksamhet mot att hitta ett sätt att dramatiskt påskynda gentekniken. Forskare hade länge infogat olika typer av DNA i celler för att försöka få dem att till exempel bekämpa patogener eller metabolisera koldioxid för att mildra klimatförändringarna. Men verktyg för att leverera det främmande DNA:t utvecklades inte lika snabbt som strategierna för att utnyttja de manipulerade cellerna, fick han veta efter att ha träffat en representant för Defense Advanced Research Projects Agency vid ett föredrag om syntetisk biologi.
Cody O'Laughlin
För att få in DNA i celler förlitar sig många forskare på elektroporering - en metod för att använda finjusterade elektriska pulser för att tillfälligt öppna porer i cellmembran. Men processen kräver att forskarna känner till det exakta elektriska fältet som öppnar porerna utan att döda cellen. Att hitta det specifika fältet och rätt tillväxtmedium för en given bakteriestam kan ta år. Och när det väl är gjort är processen att förbereda, pipettera och elektriskt zappa varje prov mödosamt långsamt. Buie uppskattar att en skicklig forskare kan elektroporera endast 20 till 50 prover per timme, vilket avsevärt begränsar antalet experiment som ett labb kan utföra.
Så med hjälp av ett DARPA-bidrag började Buie arbeta på ett snabbare sätt att elektroporera celler - och så småningom skulle han också ta itu med automatiseringen av processen. Hans team – som inkluderade LEMI postdocs Paulo Garcia och Jeffrey Moran samt doktorand Zhifei Ge, PhD '16 – använde en uppställning som liknade den i Buies tidigare dielektroforesexperiment, men de lade till mikrofluidkanalen en fluorescerande markör som skulle glöda i närvaro av DNA. Kanaler fylldes med bakterier och när de elektriska fälten ökade runt flaskhalsen öppnades membranporerna och släppte in markören. Väl inuti reagerade den med bakteriens DNA och fick cellen att glöda, vilket gav en synlig indikator på det elektriska fältet som behövs för att öppna en viss stams porer.
När forskarna väl vet det står de fortfarande inför den mödosamma uppgiften att manuellt zappa varje cell för att infoga önskat DNA. Så Buie, -Garcia och LEMI doktorandforskare Rameech -McCormack, SM ’17, designade också en pipett som applicerar det korrekta elektriska fältet när cellerna strömmar genom elektriskt laddade mikrofluidkanaler inbyggda i dess spets. Genom sin start, kallad Kytopen, konstruerar Buie och Garcia (som fungerar som Kytopens VD) ett automatiserat system utrustat med 96 eller fler simultant elektroporerande pipetter, som var och en kan hantera ett prov var åttonde till 10:e sekund. Genom att göra det möjligt att infoga DNA i bakterieceller upp till 10 000 gånger snabbare, kan enheten tillåta forskare att snabbt churna igenom miljontals variationer på ett experiment inom genteknik. (Kytopen är bland de första företagen som stöds av The Engine, MIT:s riskfond/accelerator för startups i tidiga skeden som arbetar med teknologier med stor potential men långa utvecklingstider. Se Investing in Tech That’s Worth the Wait , mars/april 2018.)
Buies nästa steg är att testköra sin elektroporationsanordning på organismer som forskare ännu inte kan genmanipulera, och han börjar med bakterier i munnen. Forsyth Institute, en ideell forskningsorganisation inom bioteknik, har isolerat hundratals varianter av mänskliga orala bakterier. Buie har slagit sig ihop med Forsyths Christopher Johnston, en mikrobiologiforskare som utvecklar metoder för att undvika cellförsvarssystem som avvisar främmande DNA. Tillsammans siktar de på att göra minst 200 bakteriestammar tillgängliga för genteknik.
Om de lyckas med att avsevärt utöka antalet organismer som forskare kan manipulera, kan forskningen en dag användas för att konstruera bakterier för viktiga tillämpningar inom hälsovård, energi, jordbruk och miljövetenskap.
Buie hoppas att hans arbete kommer att ge andra forskare möjlighet att ta sig an svårare frågor. Folk kommer att sluta säga 'jag kan inte arbeta med den buggen' eftersom de inte kan göra genetik, säger han. De kommer att säga, 'Varför försöker vi inte det här?'