211service.com
Genomkirurgi
Exakta och enkla sätt att skriva om mänskliga gener skulle äntligen kunna ge de verktyg som forskare behöver för att förstå och bota några av våra mest dödliga genetiska sjukdomar. 11 februari 2014
Under det senaste decenniet, eftersom DNA-sekvenseringsteknologi har vuxit allt snabbare och billigare, har vår förståelse av det mänskliga genomet ökat i enlighet därmed. Ändå har forskare tills nyligen förblivit i stort sett hamna när de har försökt att direkt modifiera gener i en levande cell. Ta sickle-cell anemi, till exempel. En försvagande och ofta dödlig sjukdom, den orsakas av en mutation i bara ett av en patients tre miljarder DNA-baspar. Även om detta genetiska fel är enkelt och väl studerat, är forskarna hjälplösa att rätta till det och stoppa dess förödande effekter.
Nu finns det hopp i form av nya genomtekniska verktyg, särskilt ett som heter CRISPR. Denna teknik skulle kunna göra det möjligt för forskare att utföra mikrokirurgi på gener, precist och enkelt ändra en DNA-sekvens på exakta platser på en kromosom. Tillsammans med en teknik som kallas TALENs, som uppfanns för flera år sedan, och en något äldre föregångare baserad på molekyler som kallas zinkfingernukleaser, skulle CRISPR kunna göra genterapier mer allmänt tillämpliga, ge botemedel för enkla genetiska störningar som sicklecellanemi och så småningom även leda till botemedel för mer komplexa sjukdomar som involverar flera gener. De flesta konventionella genterapier placerar grovt nytt genetiskt material på en slumpmässig plats i cellen och kan bara lägga till en gen. Däremot ger CRISPR och de andra nya verktygen också forskare ett exakt sätt att ta bort och redigera specifika bitar av DNA – även genom att ändra ett enda baspar. Detta innebär att de kan skriva om det mänskliga genomet efter behag.
Den här berättelsen var en del av vårt marsnummer 2014
- Se resten av frågan
- Prenumerera
Det kommer sannolikt att ta åtminstone flera år innan sådana ansträngningar kan utvecklas till humanterapi, men ett växande antal akademiska forskare har sett en viss preliminär framgång med experiment som involverar sicklecellanemi, HIV och cystisk fibros (se tabellen nedan). Den ena är Gang Bao, en bioteknikforskare vid Georgia Institute of Technology, som redan har använt CRISPR för att korrigera sicklecellsmutationen i mänskliga celler som odlas i en maträtt. Bao och hans team startade arbetet 2008 med hjälp av zinkfingernukleaser. När TALENs kom ut bytte hans grupp snabbt, säger Bao, och sedan började den använda CRISPR när det verktyget blev tillgängligt. Medan han har ambitioner att så småningom arbeta med en mängd olika sjukdomar, säger Bao att det är vettigt att börja med sicklecellanemi. Om vi väljer en sjukdom att behandla med genomredigering bör vi börja med något relativt enkelt, säger han. En sjukdom som orsakas av en enda mutation, i en enda gen, som bara involverar en enda celltyp.
Bao har en idé om hur en sådan behandling skulle fungera. För närvarande kan läkare bota en liten andel av sicklecellpatienter genom att hitta en mänsklig donator vars benmärg är en immunologisk matchning; kirurger kan sedan ersätta några av patientens benmärgsstamceller med donerade. Men sådana donatorer måste matchas exakt med patienten, och även då är immunavstötning – ett potentiellt dödligt problem – en allvarlig risk. Baos botemedel skulle undvika allt detta. Efter att ha skördat blodcellsprekursorer som kallas hematopoetiska stamceller från benmärgen hos en sicklecellpatient, skulle forskare använda CRISPR för att korrigera den defekta genen. Sedan skulle de genkorrigerade stamcellerna återföras till patienten och producera friska röda blodkroppar för att ersätta sicklecellerna. Även om vi kan ersätta 50 procent kommer en patient att må mycket bättre, säger Bao. Byter vi ut 70 procent blir patienten botad.
Även om genomredigering med CRISPR bara är lite över ett år gammal, håller den redan på att återuppfinna genetisk forskning. I synnerhet ger det forskare möjligheten att snabbt och samtidigt göra flera genetiska förändringar i en cell. Många mänskliga sjukdomar, inklusive hjärtsjukdomar, diabetes och diverse neurologiska tillstånd, påverkas av många varianter av både sjukdomsgener och normala gener. Att reta ut denna komplexitet med djurmodeller har varit en långsam och tråkig process. För många frågor inom biologi vill vi veta hur olika gener interagerar, och för detta behöver vi introducera mutationer i flera gener, säger Rudolf Jaenisch, biolog vid Whitehead Institute i Cambridge Massachusetts. Men, säger Jaenisch, att använda konventionella verktyg för att skapa en mus med en enda mutation kan ta upp till ett år. Om en forskare vill ha ett djur med flera mutationer måste de genetiska förändringarna göras sekventiellt och tidslinjen för ett experiment kan sträcka sig in i år. Däremot rapporterade Jaenisch och hans kollegor, inklusive MIT-forskaren Feng Zhang (en 2013 medlem av vår lista över 35 innovatörer under 35 år), förra våren att CRISPR hade tillåtit dem att skapa en stam av möss med flera mutationer på tre veckor.
Eftersom ett CRISPR-system lätt kan designas för att rikta in sig på vilken specifik gen som helst, tillåter tekniken forskare att göra experiment som undersöker ett stort antal av dem. I december skapade team under ledning av Zhang och MIT-forskaren Eric Lander bibliotek av CRISPRs, som var och en riktar sig mot en annan mänsklig gen. Dessa enorma samlingar, som står för nästan alla mänskliga gener, har gjorts tillgängliga för andra forskare. Biblioteken lovar att påskynda genomomfattande studier om genetiken hos cancer och många andra mänskliga sjukdomar.
Genom GPS
Bioteknikindustrin föddes 1973, när Herbert Boyer och Stanley Cohen satte in främmande DNA som de hade manipulerat i labbet till bakterier. Inom några år hade Boyer varit med och grundat Genentech, och företaget hade börjat använda E coli modifierad med en mänsklig gen för att tillverka insulin för diabetiker. 1974, Jaenisch , sedan vid Salk Institute for Biological Studies i San Diego, skapade den första transgena musen genom att använda virus för att spetsa djurets genom med lite DNA från en annan art. I dessa och andra tidiga exempel på genteknik var forskarna dock begränsade till tekniker som infogade det främmande DNA:t i cellen på måfå. Allt de kunde göra var att hoppas på det bästa.
Det tog mer än två decennier innan molekylärbiologer blev skickliga på att effektivt ändra specifika gener i djurs genom. Dana Carroll från University of Utah insåg att zinkfingernukleaser, konstruerade proteiner som rapporterades av kollegor vid Johns Hopkins University 1996, kunde användas som ett programmerbart verktyg för geninriktning. Ena änden av proteinet kan utformas för att känna igen en speciell DNA-sekvens; den andra änden skär DNA. När en cell sedan naturligt reparerar dessa skärsår, kan den lappa sitt genom genom att kopiera från tillfört främmande DNA. Medan tekniken äntligen gjorde det möjligt för forskare att med säkerhet göra förändringar där de vill på en kromosom, är den svår att använda. Varje modifiering kräver att forskaren konstruerar ett nytt protein som är skräddarsytt för den riktade sekvensen - en svår, tidskrävande uppgift som, eftersom proteinerna är petiga, inte alltid fungerar.
TALENs, ett annat betydande framsteg inom genredigering, kom 2010. TALENs är också proteiner som hittar och skär en önskad DNA-sekvens - men att skräddarsy dem till nya genmål är mycket lättare. Även om de representerade en stor förbättring jämfört med zinkfingrar, är TALENs dock stora proteiner som är besvärliga att arbeta med och leverera till celler.
CRISPR förändrade allt. Det ersätter de DNA-inriktade proteinerna med en kort bit av RNA som huserar på önskade gener. Till skillnad från de komplexa proteinerna kan RNA – som har nästan samma enkla struktur som DNA – göras rutinmässigt i labbet; en tekniker kan snabbt syntetisera de ungefär 20 bokstäver långa sekvenserna som metoden kräver. Systemet gör det enkelt för medicinska forskare att modifiera ett genom genom att ersätta, ta bort eller lägga till DNA.
På lite mer än ett år har CRISPR börjat återuppfinna genetisk forskning.
CRISPR står för klustrade, regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar – kluster av korta DNA-sekvenser som läser likadant framåt och bakåt, som finns i många typer av bakterier. Forskare observerade först de förbryllande DNA-segmenten på 1980-talet men förstod inte på nästan två decennier att de är en del av ett bakteriellt försvarssystem. När ett virus attackerar, kan bakterier införliva sekvenser av viralt DNA i sitt eget genetiska material och lägga dem mellan de repetitiva segmenten. Nästa gång bakterierna stöter på det viruset använder de DNA:t i dessa kluster för att göra RNA som känner igen de matchande virala sekvenserna. Ett protein kopplat till ett av dessa RNA skär sedan upp det virala DNA:t.
2012, Emmanuelle Charpentier, en medicinsk mikrobiolog som studerar patogener vid Helmholtz Center for Infection Research, och Jennifer Doudna , en samarbetspartner vid University of California, Berkeley, visade att de kunde använda ett enda RNA i samband med det skärande proteinet, ett enzym som kallas Cas9, för att skära vilken önskad DNA-sekvens som helst i provrör. Det var fortfarande osäkert om metoden skulle fungera i djurceller, men i januari 2013 kom ett dramatiskt genombrott. Zhang och George Church, en genetiker från Harvard Medical School, rapporterade separat att CRISPR/Cas9-systemet kunde användas för genredigering i cellerna hos djur, inklusive människor.
Nu behöver en forskare som vill gå efter en ny gen bara syntetisera Cas9-proteinet och lite RNA som matchar sekvenserna i målregionen. RNA:t leder sedan enzymet till det DNA som forskaren vill skära. Och eftersom samma skärprotein används oavsett mål, kan forskare designa experiment där de ändrar flera gener i en organism samtidigt med hjälp av Cas9 och flera RNA-guider. Det ger möjlighet att göra experiment som tidigare var mycket svåra eller i princip inte möjliga, säger Doudna.
Komplexa mysterier
MIT:s Zhang, som är medlem i Broad Institute och McGovern Institute for Brain Research, är intresserad av genetiken bakom psykisk ohälsa. För att försöka förstå dessa komplexa tillstånd har Zhang hjälpt till att utveckla flera gen- och neuronmodifierande verktyg, inklusive TALENs och optogenetik, en teknik som involverar styrning av neuronaktivitet med laserljus. När han först hörde talas om CRISPR, 2011, började han konstruera det för användning i mänskliga celler. Nu använder han CRISPR för att avslöja de genetiska hemligheterna bakom sådana förödande och dåligt förstådda tillstånd som schizofreni och autism.
Verktyget gör att Zhang kan börja systematiskt testa några av de DNA-varianter som har kopplats till sjukdomarna. Även om stora framsteg har gjorts under det senaste decenniet mot att identifiera gener som är vanliga hos personer med dessa tillstånd, är det en skrämmande utmaning att förstå hur dessa gener relaterar till symptomen. Det du lär dig av sekvensering är bara en observation, säger Zhang: för att förstå om en misstänkt gen faktiskt orsakar tillståndet måste du introducera den specifika mutationen i friska celler eller organismer och se vad som går fel. Om den muterade cellen eller organismen har egenskaper som efterliknar den mänskliga sjukdomen, är det bevis som implicerar genen.
Zhang kan återskapa, i både labbmöss och odlade mänskliga celler, genetiska varianter som finns hos personer med autism och schizofreni. Man kan lägga in en mänsklig mutation i motsvarande gen i ett försöksdjur och sedan se: blir det djuret mindre socialt eller har ett inlärningsunderskott? han säger. Sedan, tillägger han, kan du studera skillnader i beteendet och fysiologin hos laboratorieodlade neuroner som odlats från stamceller som har modifierats med samma mutation. Med singelgenmutationer kommer vi att börja se aspekter av den biologiska funktionen som är involverad i autism, säger han.
Zhang använder också CRISPR för att göra flera genetiska förändringar samtidigt. Det blir särskilt viktigt med komplexa sjukdomar som autism och schizofreni, som för det mesta inte orsakas av den typ av enstaka DNA-förändring som ligger bakom sicklecellanemi. Olika patienter påverkas av olika samlingar av mutationer. Att lösa ett pussel av sådan enorm komplexitet kommer att kräva stora, systematiska studier av effekterna av olika gener och hur de interagerar. CRISPR gör sådana studier möjliga, säger Zhang, och kommer att vara viktiga för att hitta behandlingar för en mängd olika komplexa sjukdomar. Vi kommer att förstå mer om vägar och sjukdomsmekanismer, säger han. Denna kunskap kommer att informera alla typer av läkemedelsutveckling.
Designer bebisar
I slutet av förra året grundade Doudna, Zhang, Church och två andra pionjärer inom genomredigering en startup som kommer att utveckla nya behandlingar för mänskliga genetiska sjukdomar. I november, Läkemedel utfärdade , meddelade att de hade samlat in 43 miljoner dollar i riskkapital och sa att de planerar att använda genomredigeringsteknologier mot ett brett spektrum av sjukdomar.
Lanseringen av Editas bör dra nytta av ett återuppvaknande intresse för genterapi tack vare år av tekniska förbättringar, inklusive säkrare mekanismer för att leverera behandling. Landskapet har förändrats för genterapi, säger Church. (Det finns fortfarande inga godkända genterapier i USA, även om ett antal är i försök på människor.) Men han säger att de terapier som Editas kommer att utveckla kommer att vara fundamentalt annorlunda än de äldre metoderna som använder ett virus för att infoga en gen i celler.
Kanske kan forskare skriva om normala gener så att människor bättre kan bekämpa infektioner.
Att göra en ändring eller en radering är utom räckhåll för de flesta av dessa enkla virala metoder, säger Church. Och att ta bort lite DNA, snarare än att lägga till en gen, kan verkligen vara nyckeln till att behandla många sjukdomar. Ta Huntingtons sjukdom. Det dödliga hjärntillståndet uppstår från en uppbyggnad av ett giftigt protein i nervceller. Att lägga till en frisk kopia av genen till cellen skulle inte påverka det proteinets giftiga aktivitet: den ursprungliga dysfunktionella versionen måste skrivas om. Med de nya genomredigeringsverktygen, säger Church, kan det vara möjligt att skriva om det defekta DNA:t: Du är inte begränsad till att lägga tillbaka något som saknas. Och, tillägger han, när man börjar inse att de vanligaste versionerna av gener inte nödvändigtvis är de idealiska versionerna, då inser man att detta är ett mycket större område. Kanske kan forskare skriva om normala gener så att människor bättre kan bekämpa infektionssjukdomar. De kanske till och med kan skaka om de molekylära vägarna som är involverade i åldrandet.
Kyrkan förutspår också att om genomredigering används för att bota barnsjukdomar, kommer vissa forskare att frestas att använda det för att konstruera embryon under provrörsbefruktning. Forskare har redan visat att genomredigering kan skriva om DNA-sekvenser i rått- och musembryon, och i slutet av januari rapporterade forskare i Kina att de hade skapat genetiskt modifierade apor med hjälp av CRISPR. Med sådana tekniker kan en persons genom redigeras före födseln - eller, om förändringar gjordes i äggen eller spermieproducerande celler hos en blivande förälder, även före befruktningen.
Dessa möjligheter väcker etiska frågor. Men om forskare visar att de säkert kan korrigera sjukdomar genom att redigera genomet, är det oundvikligt att vissa föräldrar också kommer att vilja förändra genomet hos friska embryon. Om du kan förhindra mental retardation med genterapi, förutsatt att det är tillåtet, så finns det ett helt spektrum av intellektuella utmaningar som kommer att diskuteras, säger Church.
Sådana diskussioner kommer sannolikt att hetta till när CRISPR blir mer allmänt använt. Men för närvarande utvecklas tekniken fortfarande: medan forskare som Bao, Church och Zhang i slutändan hoppas kunna bota några av våra mest svårlösta sjukdomar, går mycket av deras tid fortfarande åt att bara finjustera verktyget och utforska dess möjligheter. Men även i dessa tidiga dagar har CRISPR redan förändrat hur dessa forskare tänker på att manipulera genomet. De är inte längre.