211service.com
DNA-sekvensering i ett ögonblick
En ny sekvenseringsteknik som utvecklas av en startup i Massachusetts gör det möjligt för forskare att ta fotografier av sekvensen av en DNA-molekyl. William Glover , president av ZS Genetik , baserat i North Reading, MA, säger att hans tillvägagångssätt kommer att tillåta forskare att läsa långa DNA-sträckor, vilket möjliggör sekvensering av svårlästa områden, såsom mycket repetitiva regioner i växter och vissa delar av det mänskliga genomet. Längre sekvenser tillåter också forskare att skilja mellan moderns och faderns kromosomer, som kan ha viktiga diagnostiska tillämpningar.
Se sekvensen: Den här bilden visar ett kluster av DNA-molekyler (svarta strängar) som har syntetiserats med baser som är speciellt märkta för att vara synliga under ett elektronmikroskop. Forskare använder denna teknik för att utveckla en ny sekvenseringsteknik.
Forskare vid en nyligen genomförd sekvenseringskonferens i San Diego – där detaljer om tekniken presenterades för första gången – blev fascinerade av tillvägagångssättet eftersom det är helt annorlunda än till och med de nyaste metoderna på marknaden. Det är överraskande och potentiellt mycket kraftfullt, säger Vladimir Benes , chef för Genomics Core Facility vid European Molecular Biology Laboratory, i Tyskland.
Kostnaden för DNA-sekvensering har rasat sedan ett arbetsutkast av det mänskliga genomet färdigställdes 2001. De flesta av de senaste teknikerna som för närvarande används genererar mycket korta sekvenser, cirka 30 till 150 baspar, som sedan sys ihop med speciell programvara. Men den här metoden fångar inte alltid all information i genomet, och vissa delar av genomet är svåra att sekvensera på detta sätt, säger Glover.
ZS Genetics är en relativt nykomling på området och använder ett tillvägagångssätt som är mycket annorlunda än någon annan: elektronmikroskopi. Glover förutspår att till nästa år kommer företagets teknologi att kunna generera läsbara längder av DNA som är tusentals baspar långa, och han tror att ZS Genetics sekvenseringsmetod kommer att förbättras med en faktor 10 under de kommande åren, gör delarna ännu lättare att montera. Företaget accepterades nyligen som ett av teamen i Archon X Prize for Genomics, ett pris på 10 miljoner dollar för det första privatfinansierade teamet som kan sekvensera 100 mänskliga genom på 10 dagar.
Vilken teknik som helst som kan föra läslängden till 1 000 baspar kommer definitivt, åtminstone för de novo-sekvensering, att representera ett stort genombrott, säger Benes. Han säger att tillvägagångssättet kan vara särskilt användbart för att sekvensera arvsmassan hos växter, som ofta har mycket komplexa genom fyllda med repetitiva sekvenser som är svåra att sätta ihop beräkningsmässigt.
Vid en bredd av 2,2 nanometer är DNA osynligt under ett medelljusmikroskop.
Men elektronmikroskop, som upptäcker skillnaden i laddning mellan atomer, har en subnanometerupplösning. Medan sekvensen av naturligt DNA saknar tillräckligt med kontrast för att lösas med elektronmikroskopi, utvecklade Glover och hans kollegor ett nytt märkningssystem för att göra molekylerna mer synliga.
Forskare syntetiserar en ny komplementär sträng av molekylen som ska sekvenseras med hjälp av baser - bokstäverna som utgör DNA - märkta med jod och brom. De märkta baserna visas som antingen stora eller små prickar under elektronmikroskopet, vilket gör att forskare kan läsa sekvensen. (Tre olika märkningar kommer att krävas för att läsa sekvensen av de fyra baserna som finns i DNA. Tre av baserna kommer att ha olika märkningar; den fjärde kommer helt enkelt att förbli omärkt.)
Substratet på vilket de nyligen märkta molekylerna avbildas görs med hjälp av halvledartillverkningstekniker. Forskare genererar kiselskivor med ett 11 nanometer tjockt fönster, som är tillräckligt tunt för att elektronstrålen i mikroskopet ska kunna urskilja DNA-molekylen från substratet. ZS Genetics arbetar också med att göra ännu tunnare wafers för att öka upplösningen på bilden.
DNA har en tendens att krypa ihop till en trasslig massa, så en av de största utmaningarna har varit att reda ut den bollen till linjära strängar som kan läsas. Forskare flödar först vätska genom en mikrofluidisk enhet med små kanaler. Den enheten passar ovanpå den DNA-belagda skivan. Flödets kraft sträcker ut DNA-molekylerna, som sedan fastnar på kislet. En elektronstråle skjuts genom skivan och en kamera fångar bilden från andra sidan. Wafern är den största proprietära förbrukningsvaran, säger Glover. Det blir smutsbilligt.
När det sträcks ser DNA:t ut som en stege med baserna som bildar stegpinnarna. Hittills har företaget släppt bilder av en 23-kilobas bit DNA med en enda typ av märkt bas. Glover säger att han och hans team också har gjort multilabel-sekvensering, även om han avböjde att ge ytterligare detaljer.
Ändå har tekniken en väg att gå innan den är marknadsklar. Många principiella metoder kan fungera inom FoU, men att få ut det på [marknaden] är inte trivialt, säger Benes. Glover siktar på att ha en prototyp i sommar som forskare kan testa, och ett snabbare kommersiellt system nästa år. Han tillägger att eftersom det mesta av systemet förlitar sig på befintlig teknik, kommer det att vara enkelt och billigt att uppgradera systemet med nya kameror och mjukvara.
Längre läsningar kommer att tillåta forskare att titta på samlingar av genetiska variationer som har ärvts tillsammans, kända som haplotyper. Denna typ av analys kan avgöra om en viss genetisk variation har överförts från individens mamma eller pappa. Ny forskning tyder på att i vissa fall kan moders eller faderns arv påverka sjukdomens svårighetsgrad, ett fenomen som kan vara vanligare än man tidigare trott.